一、KI小鼠模型構建技術路線選擇
方法 | 周期 | 插入片段限制 | 適用場景 |
CRISPR-HDR | 2-4個月 | <5 kb | 快速構建短片段KI（如點突變、FLAG標簽） |
ES細胞同源重組 | 6-12個月 | 無限制 | 大片段插入（如Cre重組酶、人源化基因） |
CRISPR-轉座子/病毒 | 3-5個月 | 10-50 kb | 超大片段插入（如BAC轉基因替代） |
二、KI小鼠模型構建CRISPR-HDR方案（短片段插入推薦）
1. 靶點設計與供體制備
gRNA設計：
靶向插入位點（避開功能域），使用CHOPCHOP優化效率。
供體DNA設計：
5'同源臂 60-100nt
目標序列+篩選標記*
3'同源臂 60-100nt
化學修飾：ssODN（單鏈）需3'硫代磷酸酯化，dsDNA（雙鏈）需磷酸化。
沉默突變：在gRNA靶區引入1-2 bp突變防止重切（必需！）。
2. 受精卵注射
注射混合物：
Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。
胚胎移植：
移植20-30個注射后胚胎至假孕母鼠。
3. 基因型鑒定
PCR策略：
外側引物（同源臂外） + 內側引物（插入序列內）→ 僅陽性鼠能擴增。
測序驗證：確保插入序列無indel突變。
4. 品系建立
F0嵌合體：與野生型交配，篩選生殖系傳遞后代（通常50%概率）。
三、ES細胞同源重組方案（大片段KI）
1. 靶向載體構建
5'同源臂 1.5-3kb
目標序列
FRT-flanked NeoR
3'同源臂 1.5-3kb
DTA負選標記
關鍵元件：
同源臂：長度與插入片段正相關（>5 kb插入需≥3 kb同源臂）。
篩選標記：NeoR（后續可通過Flp刪除）。
2. ES細胞操作
電轉與篩選：
G418（NeoR）篩選10-14天，Pick 200-300個克隆。
陽性克隆驗證：
長片段PCR（覆蓋整個插入區域）。
Southern blot：確認單拷貝整合。
3. 小鼠制備
囊胚注射：將陽性ES細胞注入C57BL/6N囊胚。
傳代：嵌合體與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。
四、條件性KI（cKI）附加設計
1. 雙loxP系統
策略：在目標基因前插入loxP-stop-loxP（LSL）結構，與Cre小鼠交配后激活表達。
應用：
報告基因：Rosa26-LSL-tdTomato。
致癌基因：Kras-LSL-G12D。
2. 誘導型系統
Tet-On：rtTA + TRE-目標基因，需多xi環素誘導。
五、經典KI模型案例
插入類型 | 應用 | 代表模型 |
點突變 | 模擬人類遺傳病（如APP突變） | APP-KI（阿爾茨海默?。?/p> |
報告基因 | 細胞譜系追蹤 | Rosa26-CAG-LSL-GFP |
人源化基因 | 藥物測試 | hCYP3A4-KI（代謝研究） |
六、關鍵優化策略
提高HDR效率：
添加HDR增強劑（如Rad51 mRNA或RS-1）。
使用Cas9變體（如Cas9-D10A nickase）。
減少隨機整合：
線性化供體DNA（避免質粒骨架整合）。
表型驗證：
mRNA水平：qPCR檢測插入基因表達。
蛋白水平：抗體檢測（如HA/FLAG標簽）。
