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    分析實時PCR實驗的步驟及注意事項

    發布時間: 2025-06-26  點擊次數: 357次
      實時PCR實驗,也稱為實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR),是一種在PCR擴增反應中加入熒光基團,通過實時監測熒光信號積累來監測每次PCR循環后產物總量,進而對待測樣品中的目的序列進行定量分析的方法。
      實時PCR實驗的原理是在PCR反應體系中加入熒光染料(如SYBR Green)或熒光探針(如TaqMan探針)。這些熒光物質可以與DNA雙鏈結合,并在PCR擴增過程中隨著DNA的增加而發出熒光信號。熒光信號的強度與PCR產物的量成正比,從而可以通過熒光信號強度來推算出目標DNA或RNA的起始濃度。
      實時PCR實驗的步驟:
      1、樣品準備:包括細胞總RNA提取、RNA濃度測定、反轉錄合成cDNA模板等步驟。
      2、配樣:按照實驗需要對cDNA模板加水作適當稀釋,渦旋混勻后離心,根據實際所檢測樣品和基因的數量計算加樣體系,加入ddH2O、qPCR mix、引物等,配成一管mix,渦旋混勻后離心。
      3、加模板:在每個孔各加入一定量的cDNA模板,加樣完畢后蓋上管蓋,渦旋混勻后離心,去除氣泡。
      4、上機反應:設置反應溫度、孔板信息等參數,將樣品放入儀器中開始反應。
      5、數據導出與分析:反應結束后得到qPCR數據,根據溶解曲線查看數據的有效性,導出數據為EXCEL文件并保存,進行進一步分析。
      實時PCR實驗的注意事項:
      1、防止污染:實驗過程中要嚴格遵守操作規程,防止擴增序列的殘留污染和樣品間的交叉污染。
      2、準確加樣:使用一次性吸頭,避免吸頭長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染。
      3、設立對照:操作時設立陰陽性對照和空白對照,以驗證PCR反應的可靠性和擴增系統的可信性。
      4、重復實驗:為了驗證結果的準確性,通常需要進行重復實驗。
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